ELISA試劑盒有著準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)的諸多優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)普及，絕大多數(shù)是用于檢測(cè)未知樣本中抗原的濃度。現(xiàn)在市面上的ELISA試劑盒既有國(guó)產(chǎn)也有進(jìn)口，數(shù)量繁多令人目不暇接，而且質(zhì)量也是參差不齊，那么我們?cè)鯓硬拍苓x出zui適用的產(chǎn)品呢?首先要根據(jù)我們所要檢測(cè)的分子進(jìn)行檢測(cè)，除此以外也還有一些需要加以考量的因素，下面就為大家提供幾點(diǎn)參考。
1. 實(shí)驗(yàn)類型
ELISA試劑盒有多種類型，不過(guò)它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，就是進(jìn)行抗原捕獲。一般捕獲形式包括將抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗體進(jìn)行捕獲。In-cell ELISA和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)ELISPOT是兩種特殊的類型，In-cell ELISA需要將微孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行固定和通透化，然后再用抗體原位檢測(cè)。ELISPOT有點(diǎn)像蛋白印跡Western blot，先在帶膜的微孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后在膜上檢測(cè)細(xì)胞分泌的抗原形成斑點(diǎn)。此外，我們還需要根據(jù)自身需要選擇96孔板或是384孔板進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。
通常人們使用雙抗夾心法進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，雙抗夾心法中抗原被夾在捕獲抗體和檢測(cè)抗體之間，這種方法既靈敏又有效，受到了許多研究者的青睞。不過(guò)有時(shí)候雙抗夾心法并不是*選擇，例如有時(shí)候抗原特別小讓兩個(gè)大抗體難以附著，又或者抗體只有一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在上述情況下，競(jìng)爭(zhēng)性ELISA就更為適用，這種方法是采用帶標(biāo)記的純化抗原與樣本中無(wú)標(biāo)記的抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，以結(jié)合捕獲抗體。
2. 抗體類型
單克隆抗體和多克隆抗體都能夠用于ELISA，ELISA試劑盒實(shí)際上有時(shí)候二者結(jié)合效果更好。例如，對(duì)于雙抗夾心法而言，用多抗進(jìn)行捕獲而單抗進(jìn)行檢測(cè)有時(shí)更有幫助。多抗能夠確保捕獲所有抗原，隨后單抗再特異性檢測(cè)擁有特定抗原表位的抗原。
雙抗夾心法ELISA中捕獲抗體與檢測(cè)抗體(不論多抗還是單抗)的配對(duì)很有講究。我們不希望捕獲抗體與檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原上的同一位點(diǎn)，為此我們就需要確保捕獲抗體和檢測(cè)抗體所識(shí)別的抗原表位不存在重疊。如果捕獲抗體和檢測(cè)抗體之間發(fā)生了沖突，就會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。要避免這一問(wèn)題，我們可以選擇購(gòu)買“matched pair”的捕獲/檢測(cè)抗體對(duì)，這些打包在一起的抗體是商家經(jīng)過(guò)驗(yàn)證才推薦的好組合。
3. 交叉反應(yīng)
如果抗體間發(fā)生沖突或交叉反應(yīng)就會(huì)影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的特異性。其中抗體來(lái)源所帶來(lái)的兼容性就是交叉反應(yīng)的一個(gè)因素。盡管現(xiàn)在購(gòu)買源自動(dòng)物的抗體越來(lái)越容易，我們?nèi)杂斜匾_認(rèn)一下是否會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)的問(wèn)題。在用雙抗夾心法進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)用的二抗必須特異性針對(duì)檢測(cè)一抗，而不能與捕獲抗體起反應(yīng)。如果檢測(cè)用二抗與捕獲抗體結(jié)合，實(shí)驗(yàn)特異性就會(huì)大打折扣。通常我們選用源自不同宿主的捕獲抗體和檢測(cè)一抗，來(lái)避免上述問(wèn)題。
與此同時(shí)，了解試劑盒中提供的buffer也是有必要的(例如washing buffer和blocking buffer)，以免這些buffer含有可能影響抗原抗體相互作用的組分，使檢測(cè)結(jié)果收到影響。
4. 檢測(cè)方式
如今檢測(cè)ELISA有許多途徑，我們可以根據(jù)自己的偏好進(jìn)行選擇。ELISA試劑盒一般ELISA檢測(cè)的是酶促反應(yīng)的可溶性產(chǎn)物，抗體上結(jié)合有相應(yīng)的酶(例如通常使用的辣根過(guò)氧化物酶HRP)，而反應(yīng)體系中添加有相應(yīng)的底物(如3，3-二氨基聯(lián)苯胺DAB)。這種酶促反應(yīng)生成具有特征性的顏色，可以通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，堿性磷酸酶AP也是一種常用酶。酶可以結(jié)合在一抗上，也可以結(jié)合在二抗上，還可以使用鏈霉親和素標(biāo)記的酶與親和素標(biāo)記的一抗結(jié)合。ELISA試劑盒此外ELISA的結(jié)果檢測(cè)還包括放射性檢測(cè)、熒光檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光或顯色法檢測(cè)等。
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